Исследование цитотоксического эффекта магниевых сплавов на клеточные культуры

2019

Патология кровообращения и кардиохирургия, Vol 23, Iss 3 (2019)

Актуальность. Имплантация металлического стента всегда сопровождается риском возникновения неблагоприятных событий, таких как долгосрочная дисфункция эндотелия, постоянное физическое раздражение стенки сосуда, хронические локальные воспалительные реакции, высокий риск тромбообразования и прочее. В связи с этим актуальна разработка биодеградируемых стентов, которые будут обеспечивать необходимую поддержку на период заживления стенки сосуда и полностью резорбироваться без негативного влияния. С этой точки зрения магниевые сплавы являются самыми подходящими ввиду относительно низкой коррозионной стойкости и высокой биосовместимости. Цель. Исследовать цитотоксическую активность различных сплавов на основе магния в условиях in vitro. Методы. Для исследования методом деформационных термообработок получены 7 образцов магниевых сплавов с различным пределом текучести: 1 — MgZnZr (ZK60) 310 МПа, 2 — MgZnCa (ZX10) 60 МПа, 3 — MgZnCa (ZX40) 130 МПа, 4 — MgYZn (WZ31) 300 МПа, 5 — MgYZn (WZ31) 275 Мпа, 6 — MgYZn (WZ20) 340 МПа, 7 — MgZnZr (ZK60) 180 МПа. Данные образцы предварительно инкубировались в культуральной среде для получения экстракта, который в дальнейшем тестировался на иммортализованных фибробластах человека. Для исследования цитотоксической активности экстрактов применялись следующие методы: микротетразолиевый тест, проточная цитофлюориметрия, световая микроскопия, измерение рН экстрактов. Результаты. По итогам микротетразолиевого теста экстракт образца 7 проявил выраженную цитотоксичность: средняя выживаемость клеток 48,2 ± 1,0%, слабый цитотоксический эффект проявил экстракт образца 5 — 81,4 ± 14,0%. Микроскопический анализ показал меньшую плотность клеток в поле зрения для образцов 5 и 7. Проточная цитофлюориметрия выявила значительное увеличение некротических клеток для образца 7 (8,25%), для образцов 1 и 5 отмечено небольшое усиление некроза клеток (3,449 и 3,626% соответственно). Наиболее высокие показатели рН среды отмечены для образцов 5 и 7 (pH = 8,5). Выводы. Результаты тестов in vitro на цитотоксичность доказывают, что состав магниевого сплава и тип деформационной термомеханической обработки напрямую влияют на величину клеточного некроза, морфологию клеток и pH среды. Введение В последнее время наблюдается значительный рост применения и активное внедрение биорезорбируемых и биосовместимых материалов в медицине [1–3]. Говоря об успешности развития эндоваскулярных методов лечения ишемической болезни сердца, его врожденных пороков, а также атеросклеротических поражений периферических артерий, следует отметить, что разработка и производство различных биорезорбируемых имплантатов являются одним из перспективных и активно развивающихся направлений. В качестве основы для изготовления данных изделий используют различные сплавы коррозионностойких металлов: нитинол, нержавеющую сталь, кобальт-хром. Однако постоянное присутствие металлического каркаса в сердечно-сосудистой системе человека имеет недостатки, которые ограничивают более широкое использование. К таковым относятся: долгосрочная дисфункция эндотелия, задержка повторной эндотелизации, высокий риск тромбо­образования, постоянное физическое раздражение стенки сосуда, хронические локальные воспалительные реакции, неспособность адаптироваться к росту у молодых пациентов и невозможность повторного хирургического вмешательства [4–8]. Если учесть, что основной эффект имплантации данных металлических устройств обеспечивается за счет эффекта каркаса, а ремоделирование и заживление участка, подверженного стентированию, происходит в течение 6–12 мес., то дальнейшее присутствие металлического устройства по истечении этого времени не дает никаких полезных эффектов [9]. Таким образом, разработка биорезорбируемых имплантатов, которые обеспечивают необходимую поддержку на период заживления сосудистой стенки и полностью резорбируются без побочных эффектов для организма, имеет большие перспективы и может стать четвертой революцией в эндоваскулярной хирургии. При анализе мировой литературы установлено, что биорезорбируемый сердечно-сосудистый имплантат должен соответствовать следующим характеристикам: биосовместимость продуктов биодеградации, оптимальное время полной резорбции, достаточная радиальная жесткость на период полной неоэндотелизации [10]. С данной точки зрения магний — наиболее подходящий металл ввиду приемлемых параметров коррозионной стойкости и биосовместимости как его самого, так и продуктов его деградации [11, 12]. Более того, для замедления скорости деградации и повышения прочности магний может быть легирован одним или несколькими элементами (редкоземельными металлами, цинком и др.) [13]. В настоящее время имеется большое количество различных сплавов на основе магния, а их состав чаще всего разрабатывают в зависимости от конкретной области применения. Требование биосовместимости резко сужает диапазон допустимых легирующих элементов, что исключает из составов биодеградируемых материалов таких металлов, как алюминий, никель и так далее. С учетом роста многообразия магниевых сплавов очевидно, что поиск наиболее оптимального состава продолжается наряду с недостаточной изученностью процессов их биосовместимости, биодеградации и резорбции. Всестороннее исследование вышеупомянутых процессов позволит существенно продвинуться в данном направлении и создать биорезорбируемый сердечно-сосудистый имплантат на основе магниевого сплава с оптимальными характеристиками, полностью отвечающими современным требованиям медицинских изделий. В настоящей статье представлены результаты исследований цитотоксической активности различных сплавов на основе магния в условиях in vitro. Методы Образцы сплавов на основе магния предоставлены ФГБОУ ВО «Тольяттинский государственный университет» совместно с ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России для исследования цитотоксической активности. Условные обозначения, спецификация образцов и краткие сведения о видах применяемых деформационных обработок с указанием температурных режимов приведены в табл. 1. Для испытаний выбраны сплавы из трех систем легирования: Mg-Zn-Zr (ZK60), Mg-Zn-Ca (ZX10, ZX40) и Mg-Y-Zn (WZ20, WZ31). Все исследуемые сплавы относятся к категории биосовместимых и рассматриваются в качестве кандидатов для производства соответствующих имплантатов. Микроструктурой и механическими свойствами этих сплавов можно управлять в широких пределах путем деформационных термообработок. Для примера в табл. 1 приведены значения условного предела текучести на растяжение. Как можно видеть, данный параметр существенно отличается для выбранных сплавов. Подробно режимы обработки и получающиеся микроструктуры будут описаны в специально посвященной публикации. Краткую информацию об использованных технологиях можно найти в указанных статьях [14–17]. Для исследования цитотоксических свойств использованы следующие методы: микротетразолиевый (МТТ) тест — оценка общей токсичности сплавов; проточная цитофлюориметрия — определение наличия цитостатических свойств; световая микроскопия — оценка изменения морфологии клеток; измерение рН экстрактов — оценка влияния магния в составе сплава на кислотность среды. Все образцы предварительно инкубировались в культуральной среде для получения экстракта, который в дальнейшем тестировался на иммортализованных фибробластах человека. Иммортализованные фибробласты человека (ATCC number CRL-4058), использованные в качестве клеточной линии, культивировались в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) без антибиотика в атмосфере 5% СО2 при 37 ºС и влажности 80%. Получение экстрактов из сплавов. Для исследования цитотоксической активности сплавов получены экстракты из предоставленных образцов, согласно ГОСТ ISO 10993-5-2011. Образцы помещались в лунки 6-луночного планшета с культуральной средой. При получении экстрактов сделана поправка на разную площадь поверхности. Минимальный объем среды, необходимый для экспериментов и использованный для наименьшего образца, составлял 3 мл. Для остальных объем среды рассчитывался пропорционально площади поверхности образца (табл. 2) [18]. Образцы инкубировались при 37 °С в течение 24 ч на орбитальном шейкере OS-20 (Biosan) с частотой 80 оборотов в минуту. Спустя 24 ч инкубации полученные экстракты инкубировали с клетками в МТТ-тесте (1 мл) и 6-луночных планшетах (2 мл), которые использовали для микроскопии и проточной цитофлюориметрии. МТТ-тест выполнялся по стандартной методике [19]. В 96-луночный планшет раскапывали по 100 мкл суспензии клеток (плотность 3×104 кл/мл). Клетки инкубировали в термостате в течение 24 ч для прикрепления. Затем среду заменяли на экстракт из сплавов. Для учета концентрационной зависимости экстракта были сделаны разведения в 2, 4, 6, 8 и 10 раз. Для каждого образца выполнено по 3 повторности. В качестве отрицательного контроля использована культуральная среда, в качестве положительного – цитотоксический агент доксорубицин. Спустя 24 часа инкубации к клеткам раскапывали краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид (Sigma) по 10 мкл в лунку (концентрация красителя 3 мг/мл PBS). Через 2 ч среду отбирали, а образовавшийся формазан растворяли в 100 мкл изопропанола (Sigma). Измерение проводили с помощью планшетного спектрофотометра MultiScan FC (ThermoFischer Scientific) на длине волны 620 нм. Итоговые результаты представлены в виде средней выживаемости клеток в % по результатам 3 измерений ± SEM. Микроскопический анализ. Выполнялся на прижизненных образцах клеток. Для этого клетки высаживали в лунки 6-луночного планшета (по 10 тыс. клеток в лунку) и инкубировали в термостате в течение 24 ч для прикрепления. Затем среду заменяли на экстракт из сплавов (по 2 мл в лунку). Клетки инкубировали в течение 24 ч, затем проводили микроскопический анализ с помощью инвертированного микроскопа AxioVert Observer.Z1 (Сarl Zeiss). Фотографии получены с помощью программного обеспечения Zen 2 (Сarl Zeiss). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду, в качестве положительного – цитостатик митомицин. Проточная цитофлюориметрия. Выполнялась с помощью прибора AttuneNxT (ThermoFischer Scientific). После микроскопического анализа клетки из лунок снимали с помощью трипсина и дважды отмывали PBS по 1 мл. После второй отмывки клетки суспензировали в 1 мл PBS, окрашивали йодидом пропидия (ThermoFischer Scientific) и далее анализировали с помощью цитофлюориметра. Конечный результат представлен в виде соотношения живых и мертвых клеток при анализе не менее 60000 клеток. рН среды. Измерения проводились в Институте неорганической химии СО РАН с использованием прибора SevenCompact pH/Ion S220 (Mettler Tolledo). Результаты МТТ-тест выполнен для оценки общей цитотоксичности полученных экстрактов на иммортализованных фибробластах. Итоги представлены в виде средней выживаемости клеток в % по результатам трех измерений ± SEМ в табл. 3. Микроскопический анализ проведен для исследования изменений морфологии клеток после 24 ч инкубации с экстрактами (рис. 1). Проточная цитофлюориметрия выполнялась для уточнения механизма токсичности экстрактов (цитостатичность/цитотоксичность) с окрашиванием клеток йодидом пропидия. В случае цитостатического механизма доля мертвых клеток в популяции не увеличится, в случае усиления некроза должен наблюдаться существенный прирост процента мертвых клеток (окрашенных йодидом пропидия). Результаты представлены в виде доли некротических клеток в популяции при анализе не менее 60 тыс. клеток ниже и рис. 2. pH среды. Так как сплавы, содержащие магний, при взаимодействии с водой могут образовывать гидроксид и защелачивать среду, проведено измерение рН после инкубации экстрактов с клетками, результаты которого представлены ниже. Обсуждение Исследование посвящено оценке цитотоксичности семи магниевых сплавов, отличающихся между собой составом примесей и системой легирования. Наряду с изучением токсичности, мы исследовали и другие параметры, необходимые для оценки перспективности полученных сплавов для использования в сердечно-сосудистой хирургии: изменение морфологии клеток, степень их некротизации, изменение рН среды. Для этого из предоставленных магниевых сплавов мы получили экстракты с применением культуральной среды, которые использовали для оценки цитотоксичности. По итогам МТТ-теста показано, что экстракт образца 7 проявлял выраженную цитотоксичность, однако при разведении средой его негативное воздействие на клетки нивелировалось. Слабый токсический эффект проявился для образца 5. Образец 1 не проявил достоверной цитотоксичности, хотя тренд на негативный эффект можно отметить. Таким образом, из семи образцов выявлен лишь один относительно токсичный сплав, механизм действия которого проявился в увеличении доли некротических клеток: значительное усиление некроза отмечено при инкубации с экстрактом образца 7, что подтвердило его цитотоксический эффект. Для образцов 1 и 5 отмечено небольшое усиление некроза клеток. Также показано, что внешний вид клеток существенно не изменился при воздействии экстрактов, а визуально меньшая плотность клеток заметна в поле зрения для цитостатика митомицина, образцов 5 и 7. Наиболее высокие показатели рН среды отмечены для образцов 5 и 7, проявляющих цитотоксический эффект в разной степени. Для экстрактов наиболее токсичных образцов наблюдалось самое высокое значение рН, существенно выходящее за пределы физиологической нормы, что могло объяснить усиление некроза клеток после инкубации с экстрактом. Выводы Представленные результаты тестов in vitro на цитотоксичность доказывают, что состав магниевого сплава напрямую оказывает влияние на величину клеточного некроза, изменение морфологии клеток и pH среды. Все исследованные сплавы продемонстрировали отрицательный цитотоксический эффект, что позволяет рассматривать их в качестве кандидатов для изготовления биорезорбируемых имплантатов. Цитотоксичность, проявляемая образцами 5 и 7, относится, скорее всего, не к системе легирования, а к его химической чистоте и наличию вредных примесей. В каждой группе сплавов присутствуют образцы, демонстрирующие превосходное соотношение прочности и отрицательной цитотоксичности (образцы 1 — ZK60, 3 — ZX40, 6 — WZ20), что позволяет рационально выбирать оптимальную деформационную термомеханическую обработку для получения заданной микроструктуры в интересующей группе сплавов. Углубленный анализ и сопоставление полученных результатов с данными о составе и структуре сплавов, коррозионными и механическими свойствами и дальнейшее исследование образцов в эксперименте in vivo на лабораторных животных позволят выявить дополнительные связи между характеристиками образцов и их биологической активностью. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование Работа выполнена при поддержке Министерства науки РФ в рамках проекта RFMEFI58317X0070.

article

English
Russian

Meshalkin National Medical Research Center, 2019.

биодеградируемый стент, биосовместимость, артерии нижних конечностей, ишемическая болезнь сердца, магниевый сплав, эндоваскулярная хирургия, Surgery, RD1-811